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METODOLOGÍA EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y DE INVESTIGACIÓN EN BIOLOGÍA FUNDAMENTAL

MÓDULO 1: ARQUITECTURA MOLECULAR DE LA VIDA Y FUNDAMENTOS GENÓMICOS

Objetivo: Comprender la organización estructural y funcional de las macromoléculas biológicas y la dinámica del genoma como base de la herencia y la variabilidad biológica.

1.1. Bioquímica de los ácidos nucleicos y proteínas
1.1.1. Estructura secundaria y terciaria del ADN y ARN.
1.1.2. Cinética de desnaturalización y renaturalización (curvas Cot).
1.1.3. Dominios proteicos y plegamiento funcional.

1.2. Organización del genoma en procariontes y eucariontes
1.2.1. Estructura de la cromatina y niveles de empaquetamiento nucleosómico.
1.2.2. Elementos genéticos móviles y ADN repetitivo.
1.2.3. Organización de clústeres génicos y regiones intergénicas.

1.3. Dogma central y sus desviaciones contemporáneas
1.3.1. Mecanismos avanzados de transcripción y traducción.
1.3.2. Splicing alternativo y maduración del pre-ARNm.
1.3.3. Retrotranscripción y procesos de ARN interferente.

1.4. Genómica comparada y evolución molecular
1.4.1. Análisis de homología, ortología y paralogía.
1.4.2. Mecanismos de transferencia horizontal de genes.
1.4.3. Filogenética molecular basada en secuencias conservadas.

MÓDULO 2: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANALITOS BIOLÓGICOS

Objetivo: Dominar las técnicas críticas de aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas, garantizando la integridad y pureza necesaria para aplicaciones downstream.

2.1. Métodos de lisis y fraccionamiento celular
2.1.1. Disrupción mecánica, química y enzimática de tejidos.
2.1.2. Aislamiento de orgánulos mediante centrifugación diferencial.
2.1.3. Estrategias de estabilización de muestras (RNasas y proteasas).

2.2. Purificación avanzada de ADN
2.2.1. Extracción orgánica frente a columnas de afinidad de sílice.
2.2.2. Aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular (HMW).
2.2.3. Purificación de ADN plasmídico y mitocondrial.

2.3. Aislamiento de poblaciones de ARN
2.3.1. Extracción de ARN total y enriquecimiento de ARNm (Poly-A).
2.3.2. Purificación de micro-ARNs y ARNs no codificantes.
2.3.3. Control de calidad mediante electroforesis capilar (RIN/DIN).

2.4. Estrategias de extracción de proteínas
2.4.1. Solubilización de proteínas de membrana y citosólicas.
2.4.2. Precipitación con TCA/acetona y diálisis.
2.4.3. Cuantificación espectrofotométrica y colorimétrica (Bradford, BCA).

MÓDULO 3: TECNOLOGÍAS DE AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Objetivo: Desarrollar una competencia técnica profunda en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes especializadas para diagnóstico e investigación.

3.1. Fundamentos y optimización de la PCR convencional
3.1.1. Diseño crítico de cebadores (primers) y parámetros termocíclicos.
3.1.2. Componentes de la reacción: polimerasas de alta fidelidad y cofactores.
3.1.3. Resolución de problemas (troubleshooting) y artefactos de amplificación.

3.2. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)
3.2.1. Química de detección: SYBR Green vs. Sondas de hidrólisis (TaqMan).
3.2.2. Cuantificación relativa (método ΔΔCt) y cuantificación absoluta.
3.2.3. Criterios de normalización y selección de genes de referencia.

3.3. PCR digital (dPCR) y amplificación isotérmica
3.3.1. Principios de la PCR digital en gotas (ddPCR) para detección de variantes raras.
3.3.2. Amplificación mediada por bucle (LAMP).
3.3.3. Aplicaciones en la detección de carga viral y CNVs.

3.4. Variantes especializadas de PCR
3.4.1. RT-PCR para el análisis de transcritos.
3.4.2. PCR anidada (Nested), Multiplex y Touchdown.
3.4.3. PCR de extensión de solapamiento para mutagénesis dirigida.

MÓDULO 4: SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: DE SANGER A LA GENÓMICA DE TERCERA GENERACIÓN

Objetivo: Analizar la evolución de las tecnologías de secuenciación y su aplicación en el desciframiento de genomas complejos.

4.1. Secuenciación por terminación de cadena (Sanger)
4.1.1. Química de dideoxinucleótidos y electroforesis capilar.
4.1.2. Interpretación de electroferogramas y validación de variantes.
4.1.3. Aplicaciones actuales en la confirmación de clones y diagnósticos específicos.

4.2. Secuenciación de Nueva Generación (NGS) - Segunda Generación
4.2.1. Tecnología Illumina: Secuenciación por síntesis (SBS).
4.2.2. Preparación de librerías: Fragmentación, ligación de adaptadores y captura.
4.2.3. Plataformas de Ion Torrent y secuenciación por detección de protones.

4.3. Secuenciación de Tercera Generación (Single Molecule)
4.3.1. Secuenciación en tiempo real de molécula única (SMRT) de PacBio.
4.3.2. Tecnología de nanoporos (Oxford Nanopore): Secuenciación de lecturas largas.
4.3.3. Aplicaciones en el ensamblaje de genomas de novo y detección de modificaciones epigenéticas.

4.4. Estrategias de secuenciación dirigida y masiva
4.4.1. Secuenciación de exoma completo (WES) vs. Genoma completo (WGS).
4.4.2. Paneles de genes dirigidos en oncología y enfermedades raras.
4.4.3. Secuenciación de amplicones para estudios de microbioma (16S rRNA).

MÓDULO 5: INGENIERÍA GENÉTICA Y TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Objetivo: Capacitar en las metodologías de manipulación in vitro del ADN para la creación de organismos modificados y sistemas de expresión.

5.1. Herramientas enzimáticas de manipulación
5.1.1. Endonucleasas de restricción: Mecanismos de corte y especificidad.
5.1.2. Ligasas, fosfatasas y quinasas en la construcción de vectores.
5.1.3. Polimerasas especiales para síntesis de ADNc y mutagénesis.

5.2. Vectores de clonación y expresión
5.2.1. Plásmidos, fágmidos y cromosomas artificiales (YACs/BACs).
5.2.2. Sistemas de expresión en procariontes (E. coli) y eucariontes (levaduras, líneas celulares).
5.2.3. Promotores inducibles y etiquetas de purificación (GST, His-tag).

5.3. Métodos de transformación y transfección
5.3.1. Competencia química y electroporación en bacterias.
5.3.2. Métodos físicos y químicos en células animales (lipofección, microinyección).
5.3.3. Transducción viral: Vectores lentivirales y adenovirales.

5.4. Cribado y selección de clones recombinantes
5.4.1. Selección por antibióticos y complementación α (Blue-White screening).
5.4.2. Hibridación de colonias y PCR de colonia.
5.4.3. Verificación de la estabilidad del inserto y expresión de la proteína.

MÓDULO 6: EDICIÓN GENÓMICA Y TERAPIA GÉNICA

Objetivo: Profundizar en las tecnologías disruptivas de edición de genes (CRISPR/Cas9) y sus aplicaciones en la corrección de defectos genéticos.

6.1. Sistemas de edición programable (ZFNs y TALENs)
6.1.1. Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs): Estructura y diseño.
6.1.2. TALENs: Código de reconocimiento de bases y ensamblaje modular.
6.1.3. Limitaciones y comparación con sistemas modernos.

6.2. El sistema CRISPR/Cas9
6.2.1. Origen biológico como sistema inmune procariota.
6.2.2. Diseño de ARN guía (gRNA) y mecanismo de corte por Cas9.
6.2.3. Reparación del ADN: Unión de extremos no homólogos (NHEJ) y reparación dirigida por homología (HDR).

6.3. Variantes avanzadas de CRISPR
6.3.1. Edición de bases (Base Editing) sin ruptura de doble cadena.
6.3.2. Prime Editing: El "buscar y reemplazar" del genoma.
6.3.3. Sistemas CRISPR para el control transcripcional (CRISPRi y CRISPRa).

6.4. Aplicaciones clínicas y bioética de la edición génica
6.4.1. Terapia génica ex vivo e in vivo.
6.4.2. Estrategias de entrega: Nanopartículas lipídicas y vectores virales.
6.4.3. Consideraciones bioéticas sobre la edición en línea germinal humana.

MÓDULO 7: TRANSCRIPTÓMICA Y ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

Objetivo: Estudiar el perfil completo de ARN en un sistema biológico para entender la regulación génica global.

7.1. Microarrays de ADN
7.1.1. Principios de hibridación competitiva.
7.1.2. Diseño de chips de expresión y genotipado.
7.1.3. Análisis de datos e interpretación de mapas de calor (Heatmaps).

7.2. Secuenciación de ARN (RNA-Seq)
7.2.1. Construcción de librerías de ADNc y eliminación de ARNr.
7.2.2. Análisis de expresión diferencial (DEGs).
7.2.3. Identificación de isoformas y eventos de splicing mediante RNA-Seq.

7.3. Transcriptómica de célula única (scRNA-Seq)
7.3.1. Microfluídica y partición de células individuales.
7.3.2. Análisis de heterogeneidad celular y linajes.
7.3.3. Aplicaciones en el estudio del microambiente tumoral.

7.4. Regulación post-transcripcional
7.4.1. Interacción ARN-Proteína (RIP-Seq e iCLIP).
7.4.2. Estabilidad del ARNm y degradación mediada por microARNs.
7.4.3. Ribosome Profiling: Midiendo la traducción global.

MÓDULO 8: PROTEÓMICA Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS

Objetivo: Analizar el conjunto proteico de una célula y las interacciones moleculares que determinan el fenotipo celular.

8.1. Separación y detección de proteínas
8.1.1. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE).
8.1.2. Western Blotting avanzado: Quimioluminiscencia y fluorescencia infrarroja.
8.1.3. Ensayos de ELISA y matrices de proteínas (Antibody Arrays).

8.2. Espectrometría de masas (MS) aplicada a proteínas
8.2.1. Ionización (MALDI vs. ESI) y analizadores de masa (Orbitrap, Q-TOF).
8.2.2. Proteómica "Bottom-up" y "Top-down".
8.2.3. Cuantificación proteómica con etiquetas isobáricas (TMT/iTRAQ).

8.3. Interactómica y modificaciones post-traduccionales
8.3.1. Sistemas de doble híbrido en levadura y Co-Inmunoprecipitación (Co-IP).
8.3.2. Análisis de fosfoproteómica, glicómica y ubiquitinación.
8.3.3. FRET y BRET para el estudio de interacciones en células vivas.

8.4. Biología estructural
8.4.1. Cristalografía de rayos X y RMN de proteínas.
8.4.2. Criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) de complejos macromoleculares.
8.4.3. Predicción de estructuras mediante inteligencia artificial (AlphaFold).

MÓDULO 9: EPIGENÉTICA Y EPIGENÓMICA

Objetivo: Investigar las modificaciones heredables que regulan la actividad génica sin alterar la secuencia de ADN.

9.1. Metilación del ADN
9.1.1. ADN metiltransferasas y patrones de metilación en islas CpG.
9.1.2. Secuenciación por bisulfito (BS-Seq) y variantes.
9.1.3. Imprinting genómico y enfermedades por defectos de metilación.

9.2. Modificaciones de histonas y código de histonas
9.2.1. Acetilación, metilación y fosforilación de colas de histonas.
9.2.2. Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-Seq).
9.2.3. Complejos remodeladores de la cromatina.

9.3. Accesibilidad de la cromatina y ARN no codificantes
9.3.1. Ensayos de accesibilidad: ATAC-Seq y DNase-Seq.
9.3.2. Función de los lncRNA (Long non-coding RNAs) en la arquitectura nuclear.
9.3.3. Silenciamiento génico mediado por ARN (RNAi).

9.4. Epigenética transgeneracional y ambiental
9.4.1. Efecto del ambiente y la dieta en el epigenoma.
9.4.2. Herencia epigenética en plantas y animales.
9.4.3. Epigenética del cáncer: Hipermetilación de genes supresores de tumores.

MÓDULO 10: BIOINFORMÁTICA Y ANÁLISIS COMPUTACIONAL DE DATOS ÓMICOS

Objetivo: Proveer las herramientas computacionales necesarias para el procesamiento, análisis e interpretación de grandes volúmenes de datos biológicos.

10.1. Bases de datos biológicas y algoritmos de alineamiento
10.1.1. Curación de datos en NCBI, Ensembl y UniProt.
10.1.2. Algoritmos BLAST, FASTA y alineamiento múltiple de secuencias (MSA).
10.1.3. Búsqueda de motivos y dominios conservados.

10.2. Análisis de datos de NGS
10.2.1. Control de calidad de lecturas (FastQC) y trimado de adaptadores.
10.2.2. Mapeo contra genoma de referencia (BWA, Bowtie2).
10.2.3. Llamado de variantes (Variant Calling) y anotación funcional.

10.3. Biología de sistemas y redes metabólicas
10.3.1. Reconstrucción de redes de interacción proteína-proteína (String DB).
10.3.2. Análisis de enriquecimiento funcional (Gene Ontology y KEGG).
10.3.3. Modelado matemático de rutas metabólicas.

10.4. Programación aplicada a la biología
10.4.1. Fundamentos de R/Bioconductor para análisis estadístico genómico.
10.4.2. Automatización de pipelines con Python y BioPython.
10.4.3. Uso de entornos de computación de alto rendimiento (HPC) y contenedores (Docker/Singularity).

MÓDULO 11: METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y ÉTICA

Objetivo: Estructurar el pensamiento crítico para el diseño experimental riguroso, la gestión de proyectos y la comunicación de resultados científicos.

11.1. Diseño experimental en biología molecular
11.1.1. Formulación de hipótesis nula y alternativa.
11.1.2. Controles positivos, negativos y controles internos de carga.
11.1.3. Replicación biológica vs. replicación técnica.

11.2. Bioestadística avanzada
11.2.1. Pruebas de significancia paramétricas y no paramétricas.
11.2.2. Corrección por pruebas múltiples (FDR, Bonferroni).
11.2.3. Análisis de componentes principales (PCA) y clustering.

11.3. Redacción y comunicación científica
11.3.1. Estructura del artículo científico (IMRyD).
11.3.2. Gestión de referencias bibliográficas y software de gestión (Mendeley/Zotero).
11.3.3. El proceso de revisión por pares (Peer-review) y selección de revistas (Impact Factor).

11.4. Ética e integridad en la investigación
11.4.1. Prevención del plagio y manipulación de imágenes.
11.4.2. Ética en el uso de modelos animales y muestras humanas (Comités de Bioética).
11.4.3. Propiedad intelectual y patentes en biotecnología.

MÓDULO 12: APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA BIOMEDICINA Y BIOTECNOLOGÍA

Objetivo: Integrar los conocimientos adquiridos en soluciones prácticas para problemas contemporáneos en salud, industria y medio ambiente.

12.1. Diagnóstico molecular y medicina de precisión
12.1.1. Biomarcadores moleculares para el diagnóstico temprano.
12.1.2. Farmacogenómica: Personalización del tratamiento farmacológico.
12.1.3. Biopsia líquida y ADN circulante tumoral (ctDNA).

12.2. Biotecnología industrial y biología sintética
12.2.1. Producción de proteínas recombinantes y biofármacos.
12.2.2. Diseño de circuitos genéticos y chasis celulares.
12.2.3. Ingeniería metabólica para la producción de biocombustibles.

12.3. Biotecnología vegetal y seguridad alimentaria
12.3.1. Desarrollo de organismos genéticamente modificados (OGM) con resistencia a estrés.
12.3.2. Fitomejoramiento asistido por marcadores moleculares.
12.3.3. Detección de patógenos en cultivos mediante métodos moleculares.

12.4. Fronteras de la biología molecular
12.4.1. Organoides y modelos de órganos en un chip (Organs-on-a-chip).
12.4.2. Nanobiotecnología y biosensores.
12.4.3. El futuro de la biología cuántica y la genómica computacional extrema.

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